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功能学评价检验方法-增强免疫力功能检验方法((1)

2007-09-12 13:04 不详 佚名点击:次 【字号:
1. 实验动物 推荐用近交系小鼠,如C57BL/6J、BALB/C等,6-8周龄,18-22g,雌雄均可,数量为单一性别,每组10-15只。 2. 剂量分组及受试样品给予时间 实验

 
1. 实验动物
推荐用近交系小鼠,如C57BL/6J、BALB/C等,6-8周龄,18-22g,雌雄均可,数量为单一性别,每组10-15只。
2. 剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组,以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组,另设二各剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天,免疫模型动物实验可适当延长。
3. 实验方法
3.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
可任选下列方法之一
3.1.1 MTT法
3.1.1.1 原理
当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色结晶而显色,其光密度值能反映细胞的增殖情况。
3.1.1.2 仪器和材料
RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)
200目筛网、24孔培养板,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台
3.1.1.3 实验步骤
3.1.1.3.1 试剂配制
完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰胺(200mmol/L),青霉素(100U/mL),链霉素(100ug/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2,即完全培养液。
ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(-20℃)保存。
无菌Hank's液 用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。
MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中,现配现用。
酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl,临用前配制。
3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,用Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为3×106个/mL。
3.1.1.3.3 淋巴细胞增殖反应
将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1mL,一孔加75μL ConA 液(相当于7.5ug/mL),另一孔作为对照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/mL)50μL /孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装3~6孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中,721分光光度计上在波长570nm测定OD值。
3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。
3.1.1.5 注意事项
选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要,ConA的浓度过高会产生抑制作用,不同批号的ConA在实验前要预试,以找到最佳刺激分裂浓度。

3.1.2 同位素掺入法
3.1.2.1 原理
淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA 等的刺激下,产生增殖反应,DNA和RNA合成明显增加,如在培养液中加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
3.1.2.2 仪器和材料
RPMI-1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hank's液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)、3H-TdR、闪烁液[2,5-二苯基恶唑(PPO)0.5g、1,4-双-(5-苯基 恶唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混匀]
200目筛网,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。
3.1.2.3 实验步骤
3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗3次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×106个/mL。
3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应:
将脾细胞悬液加入到96孔培养板中,200μL/孔,每一份脾细胞悬液分装6个孔,3孔加ConA(5ug/mL),另3个孔不加ConA 作为对照。置5% CO2,37℃培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR 20μL,使其终浓度为(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7mL闪烁液,用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度,用刺激指数(SI)来表示
实验孔cpm
SI=─────────
对照孔cpm
受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值,即可判定该项实验结果阳性。

3.2 迟发型变态反应(DTH)
可任选下列方法之一
3.2.1 二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)
3.2.1.1 原理
二硝基氟苯(DNFB)是一种半抗原,将其稀释液涂抹腹壁皮肤后,与皮肤蛋白结合成完全抗原,由此刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7天 后再将其涂抹于耳部,使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24~48h达高峰,故于此时测定其肿胀程度。
3.2.1.2 材料
DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。
3.2.1.3 实验步骤
3.2.1.3.1 试剂配制 DNFB溶液 DNFB溶液应新鲜配制,称取DNFB50mg,置清洁干燥小瓶中,将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮:麻油=1:1),倒入小瓶,盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后,用250μL注射器通过瓶盖取用。
3.2.1.3.2 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛,范围约 3cm×3cm、用 DNFB 溶液50μL均匀涂抹致敏。
3.2.1.3.3 DTH的产生与测定 5天 后,用 DNFB 溶液 10μL 均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后 24h 颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片,称重。
3.2.1.4 数据处理与结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于与对照组的差值,可判定该项实验结果阳性。
3.2.1.5 注意事项
操作时应避免DNFB与皮肤接触。
3.2.2 绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)
3.2.2.1 原理
SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞,4天后,当再以SRBC攻击时,即可见攻击部位出现迟发型变态反应。
3.2.2.2 材料
游标卡尺(精密度0.02mm)、SRBC、微量注射器(50μL)。
3.2.2.3 实验步骤
3.2.2.3.1 致敏 小鼠用2%(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫,每只鼠注射0.2mL(约1×108个SRBC)。
3.2.2.3.2 DTH的产生与测定 免疫后4天,测量左后足跖部厚度,然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC,每只鼠20μL(约1×108个SRBC),注射后于24h测量左后足跖部厚度,同一部位测量三次,取平均值。
3.2.2.4 数据处理和结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH 的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值,可判定该项实验结果阳性。
3.2.2.5 注意事项
测量足跖厚度时,最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部,但不要加压,否则会影响测量结果。
攻击时所用的SRBC要新鲜(保存期不超过1周)。
3.3 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
3.3.1 原理
用绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合,在补体参与下,使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解,形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。
3.3.2 仪器和材料
二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。
3.3.3 实验步骤
3.3.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.3.3.2 制备补体 采集豚鼠血,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中, 4℃冰箱放置30min,经常振荡,离心取上清,分装,-70℃保存。用时以SA液按1∶8-15稀释。
3.3.3.3 玻片涂膜 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖(0.5g琼脂糖加双蒸水至100mL,加热溶解),待干后放片盒可长期保存备用。
3.3.3.4 免疫动物 取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min,计数细胞,每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107~2×108个。也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL。
3.3.3.5 脾细胞悬液制备
将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛有Hank's液的小平皿内,轻轻撕碎脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,离心(1000/min)10min,用Hank's液洗2遍,最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中,计数细胞,并将细胞浓度调整为5x106个/mL。也可将细胞悬浮在8mLHank's液,测定脾空斑形成数。
3.3.3.6 空斑的测定
将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后,放45℃水浴保温,与等量pH7.2~7.4、2倍浓度的Hank's液混合,分装小试管,每管0.5mL,再向管内加50μL 10% SRBC(v/v,用SA液配制),20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)或25μL脾细胞悬液,迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,做平行片,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培养箱中温育1~1.5h,然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内,继续温育1~1.5h后,计数溶血空斑数。
3.3.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示,受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数,可判定该项实验结果阳性。

3.4 血清溶血素的测定
可任选下列方法之一。
3.4.1 血凝法
3.4.1.1 原理
用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体(溶血素),利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。
3.4.1.2 仪器和材料
SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机
3.4.1.3 实验步骤
3.4.1.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4~5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。
3.4.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内,每孔100μL ,再加入100μL 0.5%(v/v)的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度。
3.4.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
血清凝集程度一般分为5级(0-Ⅳ)记录,按下式计算抗体积数,受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平,可判定该项实验结果阳性。
抗体水平=(S1+2S2+3S3……nSn)
式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别,抗体积数越大,表示血清抗体越高。
0级 红细胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圆点状,四周液体清皙。
Ⅰ级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状,四周有少量凝集的红细胞。
Ⅱ级 凝集的红细胞在孔底形成薄层,中心可以明显见到一个疏松的红点。
Ⅲ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。
Ⅳ级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,凝块有时成卷折状。
3.4.1.5 注意事项
血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。
3.4.2 半数溶血值(HC50)的测定
3.4.2.1 原理
用SRBC免疫动物后,产生抗SRBC抗体(溶血素),与SRBC一起孵育,在补体参与下,可发生溶血反应,释放血红蛋白,通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。
3.4.2.2 仪器和材料
721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都式试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g,加蒸馏水至1000mL)
3.4.2.3 实验步骤
3.4.2.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4℃冰箱保存备用,可保存2周。
3.4.2.3.2 制备补体 采集豚鼠血,分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清),将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中,放4℃冰箱30min,经常振荡,离心取上清,分装,-70℃保存。用时以SA液按1∶8稀释。
3.4.2.3.3 免疫动物及血清分离 取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,,每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4~5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,使血清充分析出,2000r/min离心10min,或6000r/min,4min,收集血清。
3.4.2.3.4 溶血反应 取血清用SA缓冲液稀释(一般为200~500倍)。将稀释后的血清1mL置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL,补体1mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温15~30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL,加都氏试剂3mL,同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。
3.4.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示,按下列公式计算,受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50,可判定该项实验结果阳性。
样品光密度值
样品HC50=─────────────────×稀释倍数
SRBC半数溶血时的光密度值

3.5 小鼠碳廓清实验
3.5.1 原理
在一定范围内,碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系,即吞噬速度与血碳浓度成正比,而与已吞噬的碳粒量成反比。
以血碳浓度对数值为纵座标,时间为横座标,两者呈直线关系。此直线斜率(K)可表示吞噬速率,亦可称为未经校正的吞噬指数。因动物肝、脾重量不等,故K值亦不同。为此,一般以校正的吞噬指数a表示。a反映了每单位组织重量的吞噬活性,公式如下:

3.5.2 仪器和试剂
721分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3
3.5.3 实验步骤
3.5.3.1 溶液配制
注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释3~4倍。
Na2CO3溶液 取0.1gNa2CO3,加蒸馏水至100mL。
3.5.3.2 注射墨汁 称体重,从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁,按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入,立即计时。
3.5.3.3 测定
注入墨汁后2、10min,分别从内眦静脉丛取血20μL,并立即将其加到 2mL 0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD),以Na2CO3溶液作空白对照。
将小鼠处死,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,称重。
3.5.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数,可判定该项实验结果阳性。
lgOD1-lgOD2
K=───────
t2-t1


3.5.5 注意事项
静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。
墨汁放置中,碳粒可沉于瓶底,临用前应摇匀。
使用新的墨汁时,应在实验前摸索一个最适墨汁注入量,即正常小鼠在20~30min内不易廓清,而激活的小鼠可明显廓清。

(责任编辑:中国注册申报网)
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