中检院关于公开征求《化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法（征求意见稿）》等2项化妆品标准意见的通知

各有关单位：

为进一步完善化妆品技术标准，中检院组织制定了《化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法》等2项化妆品标准制修订项目征求意见稿（附件1—2），现公开征求意见。请按要求在“化妆品标准制修订管理系统”（https://www.nifdc.org.cn/nifdc/bshff/hzhpbzh/hzhpbzhxt/index.html）中反馈意见，截止时间为2026年8月30日。 

附件：1.《化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法（征求意见稿）》及起草说明

    2.《化妆品中乙醇等40种原料的检验方法（征求意见稿）》及起草说明

中检院

2026年7月21日

附件1

化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法（征求意见稿）

Detection of Pseudomonas aeruginosa in Cosmetics

1  范围

本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法。

本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验。

2 定义

2.1铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa

属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，在42±1 ℃条件下能生长。大部分能产生绿脓菌素。

3 菌种

注：用于适用性试验和检验过程中的质量控制。

*可使用其他菌种保藏机构的等效标准菌株。

4 设备和材料

4.1 恒温培养箱：36±1 ℃、42±1 ℃。

4.2 三角瓶：150 mL、200 mL、250 mL。

4.3 试管：18 mm×150 mm。

4.4 灭菌平皿：直径90 mm。

4.5 灭菌刻度吸管：1 mL(具0.01 mL刻度）、10 mL(具0.1 mL刻度）或者相应的可调量程移液器及配套灭菌吸头。

4.6 显微镜。

4.7 载玻片。

4.8 接种针、接种环。

4.9 电磁炉。

4.10 高压灭菌器。

4.11 恒温水浴箱。

4.12 天平。

4.13 pH计或pH试纸。

5 培养基和试剂

5.1 SCDLP液体培养基。

见总则附录A.1。

5.2 假单胞菌琼脂基础培养基（CN琼脂）。

成分：明胶蛋白胨                16.0g

胰蛋白胨                  10.0g

硫酸钾                   10.0 g

氯化镁                     1.4 g

甘油                      10 mL

溴化十六烷基三甲铵         0.2 g

萘啶酮酸                 0.015g

琼脂                        15 g

蒸馏水                  1000 mL

pH      7.1±0.2

制法：将明胶蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸钾、氯化镁加到蒸馏水中，加热使其溶解，加入琼脂和10 mL甘油，煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min。待培养基冷却至45~50 ℃时，加入溶于2 mL灭菌蒸馏水的溴化十六烷基三甲铵和萘啶酮酸，混匀，制成平板备用。

5.3 乙酰胺培养基

成分：乙酰胺                    10.0 g

氯化钠                     5.0g

无水磷酸氢二钾           1.39 g

无水磷酸二氢钾           0.73 g

硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）      0.5 g

酚红                     0.012 g

琼脂                        20 g

蒸馏水                 1000 mL

pH      7.2±0.2

制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，加入琼脂、酚红，121 ℃高压灭菌20 min后，制成平板备用。

5.4 胰酪大豆胨琼脂（TSA）

成分：胰酪胨                    15.0 g

大豆蛋白胨                 5.0 g

氯化钠                     5.0 g

琼脂                      15.0 g

蒸馏水                   1000 mL

pH        7.3±0.2

制法：除琼脂外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，加入琼脂，121 ℃高压灭菌15 min后，制成平板备用。

5.5 绿脓菌素测定用培养基

成分：蛋白胨                    20.0 g

氯化镁                     1.4 g

硫酸钾                    10.0 g

琼脂                      18.0 g

甘油（化学纯）            10.0 g

蒸馏水                  1000 mL

pH       7.4±0.2

制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加热使其溶解，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115 ℃高压灭菌20 min后，制成斜面备用。

5.6 硝酸盐蛋白胨水培养基

成分：蛋白胨                    10.0 g

酵母浸膏                   3.0 g

硝酸钾                     2.0 g

亚硝酸钠                   0.5 g

蒸馏水                  1000 mL

pH       7.2±0.2

制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115 ℃高压灭菌20 min后备用。

5.7 明胶培养基

成分：牛肉膏                     3.0 g

蛋白胨                     5.0 g

明胶                     120.0 g

蒸馏水                  1000 mL

pH        7.4±0.2

制法：取各成分加到蒸馏水中浸泡20 min，随时搅拌加热使之溶解，分装于试管内，经115 ℃高压灭菌20 min后，直立制成高层备用。

5.8 普通琼脂斜面培养基

成分：蛋白胨                    10.0 g

牛肉膏                     3.0 g

氯化钠                     5.0 g

琼脂                      15.0 g

蒸馏水                  1000 mL

pH          7.2±0.2

制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121 ℃高压灭菌20 min后，制成斜面备用。

6 操作步骤

6.1 样品的稀释

按照微生物检验方法总则4.3制备1:10检液。

6.2 增菌培养

取1:10检液10 mL加到90 mL SCDLP液体培养基中，置36±1 ℃培养18~24 h。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。

6.3 分离培养

将增菌后的培养物，划线接种在CN琼脂培养基平板上，置36±1 ℃培养24~48 h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，大部分菌落呈现蓝色或绿色。若菌落非蓝、绿色而在紫外光照射下发荧光，或菌落呈现红褐色而在紫外照射下不发荧光，亦为可疑菌落需进行后续鉴定实验。

在缺乏CN琼脂培养基时也可用乙酰胺培养基作为替代培养基进行分离，将增菌后的培养物划线接种于平板上，置36±1 ℃培养24~48 h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色。

6.4 分纯

挑取CN琼脂培养基上的可疑菌落分区划线接种于胰酪大豆胨琼脂（TSA），于36±1 ℃培养18~24 h。

6.5 染色镜检

挑取TSA上可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行后续鉴定试验。

6.6 氧化酶试验

取一小块洁净的白色滤纸片置于灭菌平皿内，用无菌接种环挑取铜绿假单胞菌可疑菌落，涂在白色滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，若在15~30 s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。铜绿假单胞菌为氧化酶试验阳性。

6.7 绿脓菌素试验

取可疑菌落2~3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置36±1 ℃培养24±2 h，加入三氯甲烷3~5 mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内，待三氯甲烷提取液呈蓝色时，用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。

6.8 硝酸盐还原产气试验

挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置36±1 ℃培养24±2 h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。铜绿假单胞菌能够还原硝酸盐，结果为阳性。

6.9 明胶液化试验

挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36±1 ℃培养24±2 h，取出放置于4±2 ℃冰箱10~30 min，如仍呈溶液状或表面液化时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。铜绿假单胞菌为明胶液化试验阳性。

6.10 42 ℃生长试验

挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42±1 ℃培养箱中，培养24~48 h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。

6.11 其他鉴定方法

如使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可按生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统的操作说明进行鉴定。

7 检验结果报告

被检样品经增菌分离培养后，平板上有可疑菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而明胶液化、硝酸盐还原产气和42 ℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。

此外，采用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统所得出的阳性鉴定结果，亦可用于报告检出铜绿假单胞菌。

化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法（征求意见稿）起草说明

为加强化妆品的监督管理，进一步提高化妆品使用安全性，国家药监局化妆品标准化技术委员会组织开展了《化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法》的研究修订工作。现就工作有关情况说明如下：

一、起草原则

本标准规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法，适用于市面上常见的化妆品品类。为保证评价方法的科学性，本次验证在样品选择上涵盖了市场上常见的化妆品类别，同时组织3家实验室进行协作验证，充分考量了实测数据的可靠性、重复性和准确性。

二、起草过程

化妆品标准化技术委员会于2025年2月委托开展了《化妆品安全技术规范》（以下简称《规范》）中铜绿假单胞菌检验方法的修订工作。具体起草过程包括：拟定研究内容，修订铜绿假单胞菌检验方法，并完成实验室内方法学验证。2025年10月委托3家实验室开展实验室间方法学验证，修改完善形成标准草案。2026年3月25日，检验检测分技术委员会召开会议进行初审，初审结论为修改完善后同意结题，根据初审意见，修改完善了标题、文本格式、起草说明内容，并补充了油性样品的适用性实验等，形成该征求意见稿。

三、与我国已有相关标准的关系

目前我国铜绿假单胞菌的检验方法主要包括《中华人民共和国药典》、GB 8538-2022《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》。

表1 国内主要相关标准列表

四、与《规范》中原方法的对比情况

表2 与原方法的对比情况

五、国际相关标准情况

国际上主要的铜绿假单胞菌检验方法为ISO 22717：2015 Cosmetics — Microbiology — Detection of Pseudomonas aeruginosa和USP <62> MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMS。

表3 国际主要相关标准列表

六、实验室验证情况

本次铜绿假单胞菌检验方法的修订，在系统比对不同标准中分离培养基配方的基础上，明确了方法所用培养基的具体配方。同时，针对各标准在生化鉴定方面的差异，本研究对原检验方法中生化鉴定组合进行了全面评估，以确定其能否满足检验要求。同时验证了包含水剂、膏霜、乳液、粉剂、油基、蜡基、彩妆类化妆品基质的方法适用性。在确定上述关键条件后，方法起草组拟定检验方法，并对该方法的专属性、检出限和适用性进行了系统验证，同时组织3家外部实验室开展实验室间验证，充分考察了实测数据的可靠性、重复性和准确性。

综合以上验证结果，本铜绿假单胞菌检验方法具备良好的适用性与重现性，可用于各类化妆品及牙膏产品的微生物检验工作。

七、其他应予以说明的事项

本方法体例主要参照《规范》微生物检验方法的体例，方便化妆品检验领域相关检验人员的阅读和使用。根据《化妆品标准形式和实施过渡期确定原则（试行）》，建议发布形式为纳入《规范》，实施过渡期为9个月。